Er zijn veel onbezongen helden om ons heen, die ogenschijnlijk gewoon zijn, maar in werkelijkheid stilletjes een grote bijdrage aan ons leveren. Proteinase K is zo'n "onbezongen held" in de moleculaire diagnostiek. Hoewel het, vergeleken met de "grote en machtige" spelers in de sector, zo onopvallend is dat we het belang ervan lange tijd over het hoofd hebben gezien. Met de uitbraak van de coronapandemie is de vraag naar proteinase K enorm gestegen, terwijl het aanbod in binnen- en buitenland ver achterblijft bij de vraag. Iedereen realiseerde zich plotseling hoe belangrijk proteinase K is.
Waarvoor wordt proteinase K gebruikt?
Proteinase K is een serineprotease met proteolytische enzymactiviteit en kan zijn activiteit behouden in een breed scala aan omgevingen (pH (4-12,5), buffers met een hoog zoutgehalte, hoge temperaturen tot 70 °C, enz.). Bovendien wordt de activiteit van proteinase K niet geremd door SDS, ureum, EDTA, guanidinehydrochloride, guanidine-isothiocyanaat, enz., en kan een bepaalde hoeveelheid detergent de activiteit van proteinase K zelfs verhogen. Proteinase K vindt toepassingen in de medische sector (desinfectie van virussen en microben), de voedingsmiddelenindustrie (vleesvermalsing), de leerindustrie (haarverzachting), de wijnproductie (alcoholklaring), de bereiding van aminozuren (gedegradeerde veren), nucleïnezuurextractie, in situ hybridisatie, enz. De meest voorkomende toepassing is nucleïnezuurextractie.
Proteinase K kan alle soorten eiwitten in het monster enzymatisch afbreken, inclusief de histonen die stevig aan nucleïnezuren gebonden zijn. Hierdoor kunnen de nucleïnezuren uit het monster vrijkomen en in het extract worden gebracht, wat de volgende stap van extractie en zuivering vergemakkelijkt. Bij de detectie van viraal nucleïnezuur is proteinase K een van de belangrijkste componenten in de virusmonsteroplossing. Proteinase K kan het coatproteïne van het virus afbreken en inactiveren, wat veiliger is tijdens transport en detectie. Bovendien kan proteinase K ook RNase afbreken, waardoor de afbraak van viraal RNA wordt voorkomen en de detectie van nucleïnezuur wordt vergemakkelijkt.
De plotselinge roem van proteïnase K.
Zowel in de wetenschappelijke onderzoekswereld als in de IVD-sector is nucleïnezuurextractie een van de meest fundamentele experimenten. Proteïnase K is daarom altijd een zeer belangrijk enzym geweest. In het verleden was de rol van proteïnase K echter veel minder bekend dan de werkelijke waarde ervan. Dit kwam grotendeels doordat de vraag naar en het aanbod van proteïnase K zeer stabiel waren. Weinig mensen zouden zich realiseren dat de beschikbaarheid van proteïnase K een probleem zou kunnen vormen.
Met de uitbraak van de coronapandemie is de vraag naar nucleïnezuurtesten enorm gestegen. Eind juni 2020 had China al bijna 90 miljoen coronatesten uitgevoerd, een aantal dat wereldwijd nog alarmerender is. Bij nucleïnezuurextractie-experimenten ligt de werkconcentratie van proteinase K rond de 50-200 μg/ml. Over het algemeen is ongeveer 100 μg proteinase K nodig om een nucleïnezuurmonster te extraheren. In de praktijk wordt, om de efficiëntie van de nucleïnezuurextractie te verhogen, vaak een hogere concentratie proteinase K gebruikt. De nucleïnezuurdetectie van het nieuwe coronavirus heeft geleid tot een enorme vraag naar proteinase K. Het oorspronkelijke evenwicht tussen vraag en aanbod van proteinase K werd snel verstoord en proteinase K werd van de ene op de andere dag een belangrijk middel voor epidemiebestrijding.
Moeilijkheden bij de productie van proteinase K
Hoewel het belang van proteinase K door de ontwikkeling van de epidemie steeds meer is erkend, is het gênant dat, vanwege de geringe bekendheid van proteinase K, slechts weinig binnenlandse bedrijven zich met de productie ervan bezighouden. Bij het opzetten van een proteinase K-productie bleek tijdens het productieproces dat proteinase K een zeer specifiek eiwit is. Het is daardoor een enorme uitdaging om de productiecapaciteit van proteinase K op korte termijn uit te breiden.
De grootschalige productie van proteinase K stuit op de volgende moeilijkheden.
1. Lage expressie
Proteinase K kan de meeste eiwitten niet-specifiek afbreken en ernstige toxiciteit veroorzaken in de gastcel waarin het tot expressie komt. Daarom is het expressieniveau van proteinase K over het algemeen erg laag. Het screenen van expressiesystemen en -stammen die proteinase K in hoge mate tot expressie brengen, vereist doorgaans een langere cyclus.
2. Resten van pigmenten en nucleïnezuren
Gisting op grote schaal introduceert een grote hoeveelheid pigment en resten van gastheer-nucleïnezuren. Het is moeilijk om deze onzuiverheden te verwijderen met een eenvoudig zuiveringsproces, en complexe zuivering verhoogt de kosten en verlaagt het rendement.
3. Instabiliteit
Proteinase K is niet stabiel genoeg, het kan enzymatisch worden afgebroken en het is moeilijk om het zonder beschermingsmiddel langdurig stabiel te bewaren bij 37 °C.
4. Gemakkelijk te laten neerslaan
Bij de bereiding van gevriesdroogd proteïnase K-poeder is het, om een hoog gehalte aan vaste stoffen in het poeder te garanderen, noodzakelijk om een vriesdroogbeschermingsmiddel in hoge concentratie toe te voegen. Echter, wanneer de proteïnase K-concentratie 20 mg/ml of hoger bereikt, treedt gemakkelijk aggregatie en neerslagvorming op, wat het vriesdrogen van proteïnase K met een hoog gehalte aan vaste stoffen aanzienlijk bemoeilijkt.
5. Grote investering
Proteinase K heeft een sterke protease-activiteit en kan andere proteasen in het laboratorium hydrolyseren. Daarom vereist de productie van proteinase K gespecialiseerde ruimtes, apparatuur en personeel voor onderzoek, ontwikkeling en productie.
XD BIOCHEM's proteinase K-oplossing
XD BIOCHEM beschikt over een volwaardig platform voor eiwitexpressie en -zuivering en heeft ruime ervaring in de expressie en zuivering van recombinante eiwitten en de optimalisatie van productieprocessen. Dankzij de snelle opbouw van een onderzoeks- en ontwikkelingsteam is het grootschalige productieproces van proteinase K succesvol afgerond. De maandelijkse productie van gevriesdroogd poeder bedraagt meer dan 30 kg. Het product heeft stabiele prestaties, een hoge enzymspecifieke activiteit en is vrij van gastheercytochroom- en nucleïnezuurresiduen. Neem contact op met XD BIOCHEM voor een proefpakket (e-mail:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
De technische oplossingen van XD BIOCHEM omvatten:
Door middel van multi-copy plasmide-integratie worden stammen met een hoge expressie (8 g/L) geselecteerd, waarmee het probleem van een lage expressie van proteinase K wordt opgelost.
Door middel van een meerstaps zuiveringsproces werden de gastheercytochroom- en nucleïnezuurresiduen van proteinase K succesvol verwijderd tot onder de standaardwaarde.
Door middel van high-throughput screening van beschermende bufferformuleringen werd een buffer geselecteerd die proteinase K stabiel kan opslaan bij 37 °C.
Door gebruik te maken van screeningsbuffers wordt het probleem ondervangen dat proteinase K bij hoge concentraties gemakkelijk aggregeert en neerslaat, en wordt de basis gelegd voor het vriesdrogen van proteinase K met een hoog vaststofgehalte.
XD BIOCHEM proteïnase K-monster
XD BIOCHEM stabiliteitstest voor proteinase K: er zal na 80 dagen bij kamertemperatuur geen significante verandering in activiteit optreden.
XD BIOCHEM stabiliteitstest voor proteinase K: er zal na 80 dagen bij kamertemperatuur geen significante verandering in activiteit optreden.
Vergelijking van het extractie-effect van nucleïnezuur met XD BIOCHEM proteinase K en concurrerende producten. Bij de extractie van nucleïnezuren worden respectievelijk XD BIOCHEM en concurrerende proteinase K gebruikt. De extractie-efficiëntie van XD BIOCHEM proteinase K is hoger en de Ct-waarde van het doelgen is lager.
Geplaatst op: 31 december 2021