IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) is een analoog van het β-galactosidase-substraat, dat een hoge inductieve werking heeft. Onder invloed van IPTG kan de inductor een complex vormen met het repressoreiwit, waardoor de conformatie van het repressoreiwit verandert. Hierdoor kan het zich niet binden aan het doelgen, waardoor het doelgen efficiënt tot expressie komt. Hoe moet de concentratie van IPTG tijdens het experiment worden bepaald? Is een hogere concentratie beter?
Laten we eerst het principe van IPTG-inductie begrijpen: het lactose-operon (element) van E. coli bevat drie structurele genen, Z, Y en A, die respectievelijk coderen voor β-galactosidase, permease en acetyltransferase. lacZ hydrolyseert lactose tot glucose en galactose, of tot allolactose; lacY zorgt ervoor dat lactose uit de omgeving door het celmembraan kan en de cel binnenkomt; lacA draagt de acetylgroep van acetyl-CoA over op β-galactoside, wat het toxische effect tenietdoet. Daarnaast is er een werkingssequentie O, een startsequentie P en een regulerend gen I. Het gen I codeert voor een repressoreiwit dat kan binden aan positie O van de werkingssequentie, waardoor het operon (meta) wordt onderdrukt en uitgeschakeld. Er is ook een bindingsplaats voor het katabolische genactivatorproteïne (CAP) stroomopwaarts van de initiërende sequentie P. De P-sequentie, de O-sequentie en de CAP-bindingsplaats vormen samen het regulerende gebied van het lac-operon. De coderende genen van de drie enzymen worden door hetzelfde regulerende gebied gereguleerd om de gecoördineerde expressie van genproducten te bewerkstelligen.
Bij afwezigheid van lactose bevindt het lac-operon (meta) zich in een toestand van repressie. In deze toestand bindt de lac-repressor, tot expressie gebracht door de I-sequentie onder controle van de PI-promotorsequentie, aan de O-sequentie. Dit voorkomt dat RNA-polymerase aan de P-sequentie bindt en remt de transcriptie-initiatie. Wanneer lactose aanwezig is, kan het lac-operon (meta) worden geïnduceerd. In dit operon (meta)-systeem is lactose zelf niet de eigenlijke inductor. Lactose komt de cel binnen en wordt door β-galactosidase omgezet in allolactose. Deze allolactose bindt als inductor aan het repressoreiwit en verandert de conformatie van het eiwit, wat leidt tot de dissociatie van het repressoreiwit van de O-sequentie en transcriptie. Isopropylthiogalactoside (IPTG) heeft hetzelfde effect als allolactose. Het is een zeer krachtige inductor die niet door bacteriën wordt afgebroken en zeer stabiel is, waardoor het veelvuldig in laboratoria wordt gebruikt.
Hoe bepaal je de optimale concentratie van IPTG? Neem E. coli als voorbeeld.
De genetisch gemodificeerde E. coli BL21-stam met het positieve recombinante pGEX (CGRP/msCT) werd geënt in LB-vloeistofmedium met 50 μg·mL⁻¹ Amp en een nacht gekweekt bij 37 °C. Deze kweek werd vervolgens geënt in 10 flessen van 50 ml vers LB-vloeistofmedium met 50 μg·mL⁻¹ Amp in een verhouding van 1:100 voor verdere kweek. Toen de OD600-waarde 0,6-0,8 bedroeg, werd IPTG toegevoegd tot de eindconcentratie 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 en 1,0 mmol·L⁻¹. Na inductie bij dezelfde temperatuur en tijd werd 1 ml van de bacteriële oplossing afgenomen. De bacteriële cellen werden verzameld door centrifugatie en onderworpen aan SDS-PAGE om de invloed van verschillende IPTG-concentraties op de eiwitexpressie te analyseren. Vervolgens werd de IPTG-concentratie met de hoogste eiwitexpressie geselecteerd.
Na experimenten blijkt dat de IPTG-concentratie niet zo hoog mogelijk moet zijn. Dit komt doordat IPTG een zekere toxiciteit voor bacteriën heeft. Een te hoge concentratie kan de cel doden. Over het algemeen geldt dat hoe meer oplosbaar eiwit er in de cel tot expressie komt, hoe beter. Echter, bij een te hoge IPTG-concentratie worden vaak grote hoeveelheden insluitsels gevormd, terwijl de hoeveelheid oplosbaar eiwit afneemt. Daarom is de meest geschikte IPTG-concentratie vaak niet zozeer hoger, maar juist lager.
Het doel van inductie en kweek van genetisch gemodificeerde stammen is het verhogen van de opbrengst van het beoogde eiwit en het verlagen van de kosten. De expressie van het doelgen wordt niet alleen beïnvloed door de eigen factoren van de stam en het expressieplasmide, maar ook door andere externe omstandigheden, zoals de concentratie van de inductor, de inductietemperatuur en de inductietijd. Daarom is het over het algemeen raadzaam om, voordat een onbekend eiwit tot expressie wordt gebracht en gezuiverd, de inductietijd, temperatuur en IPTG-concentratie te bestuderen om de juiste omstandigheden te selecteren en de beste experimentele resultaten te verkrijgen.
Geplaatst op: 31 december 2021