IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) is een analoog van β-galactosidase-substraat, dat zeer induceerbaar is.Onder de inductie van IPTG kan de inductor een complex vormen met het repressoreiwit, zodat de conformatie van het repressoreiwit wordt veranderd, zodat het niet kan worden gecombineerd met het doelgen en het doelgen efficiënt tot expressie wordt gebracht.Dus hoe moet de concentratie IPTG tijdens het experiment worden bepaald?Is hoe groter hoe beter?
Laten we eerst het principe van IPTG-inductie begrijpen: het lactose-operon (element) van E. coli bevat drie structurele genen, Z, Y en A, die respectievelijk coderen voor β-galactosidase, permease en acetyltransferase.lacZ hydrolyseert lactose tot glucose en galactose, of tot allo-lactose;lacY zorgt ervoor dat lactose in de omgeving door het celmembraan kan gaan en de cel binnen kan komen;lacA brengt de acetylgroep over van acetyl-CoA naar β-galactoside, wat het verwijderen van het toxische effect inhoudt.Daarnaast is er een operationele sequentie O, een startsequentie P en een regulerend gen I. De I-gencode is een repressoreiwit dat kan binden aan de positie O van de operatorsequentie, waardoor het operon (meta) wordt onderdrukt en uitgeschakeld.Er is ook een bindingsplaats voor de katabole genactivatoreiwit-CAP-bindingsplaats stroomopwaarts van de initiërende sequentie P. De P-sequentie, de O-sequentie en de CAP-bindingsplaats vormen samen het regulerende gebied van het lac-operon.De coderende genen van de drie enzymen worden gereguleerd door hetzelfde regulerende gebied om de gecoördineerde expressie van genproducten te bereiken.
Bij afwezigheid van lactose bevindt het lac-operon (meta) zich in een staat van repressie.Op dit moment bindt de lac-repressor die tot expressie wordt gebracht door de I-sequentie onder de controle van de PI-promotorsequentie aan de O-sequentie, wat verhindert dat RNA-polymerase aan de P-sequentie bindt en de initiatie van de transcriptie remt;als lactose aanwezig is, kan het lac-operon (meta) worden geïnduceerd. In dit operon (meta)-systeem is de echte inductor niet lactose zelf.Lactose komt de cel binnen en wordt gekatalyseerd door β-galactosidase om te worden omgezet in allolactose.Dit laatste bindt zich als inductormolecuul aan het repressoreiwit en verandert de eiwitconformatie, wat leidt tot de dissociatie van het repressoreiwit van de O-sequentie en transcriptie.Isopropylthiogalactoside (IPTG) heeft dezelfde werking als allolactose.Het is een zeer krachtige inductor, die niet door bacteriën wordt gemetaboliseerd en zeer stabiel is, daarom wordt het veel gebruikt in laboratoria.
Hoe bepaal ik de optimale concentratie IPTG?Neem E. coli als voorbeeld.
De genetisch gemanipuleerde E. coli BL21-stam die de positieve recombinante pGEX (CGRP/msCT) bevatte, werd geïnoculeerd in vloeibaar LB-medium dat 50 μg·mL-1 Amp bevatte, en overnacht gekweekt bij 37°C.De bovenstaande cultuur werd geïnoculeerd in 10 flessen van 50 ml vers LB-vloeibaar medium dat 50 μg · ml-1 Amp bevatte in een verhouding van 1:100 voor expansiecultuur, en toen de OD600-waarde 0,6 ~ 0,8 was, werd IPTG aan de eindconcentratie toegevoegd.Het is 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Na inductie bij dezelfde temperatuur en hetzelfde tijdstip werd er 1 ml van de bacteriële oplossing uitgenomen en werden de bacteriële cellen verzameld door centrifugatie en onderworpen aan SDS-PAGE om de invloed van verschillende IPTG-concentraties op de eiwitexpressie te analyseren, en vervolgens selecteer de IPTG-concentratie met de grootste eiwitexpressie.
Na experimenten zal blijken dat de concentratie IPTG niet zo groot mogelijk is.Dit komt omdat IPTG een bepaalde toxiciteit voor bacteriën heeft.Het overschrijden van de concentratie zal ook de cel doden;en in het algemeen hopen we dat hoe beter oplosbaar eiwit tot expressie wordt gebracht in de cel, hoe beter, maar in veel gevallen zal er, wanneer de concentratie IPTG te hoog is, een grote hoeveelheid inclusie worden gevormd.Lichaam, maar de hoeveelheid oplosbaar eiwit nam af.Daarom is de meest geschikte IPTG-concentratie vaak niet hoe groter hoe beter, maar hoe lager de concentratie.
Het doel van de inductie en kweek van genetisch gemanipuleerde stammen is het verhogen van de opbrengst van het doeleiwit en het verlagen van de kosten.De expressie van het doelgen wordt niet alleen beïnvloed door de eigen factoren van de stam en het expressieplasmide, maar ook door andere externe omstandigheden, zoals de concentratie van de inductor, de inductietemperatuur en de inductietijd.Daarom is het in het algemeen het beste om, voordat een onbekend eiwit tot expressie wordt gebracht en gezuiverd, de inductietijd, temperatuur en IPTG-concentratie te bestuderen om de juiste omstandigheden te selecteren en de beste experimentele resultaten te verkrijgen.
Posttijd: 31 december 2021