Dithiothreitol (DTT) is een veelgebruikt reductiemiddel, ook wel bekend als het nieuwe groene additief. Het is een kleine organische verbinding met twee mercaptaangroepen (-SH). Vanwege zijn reducerende eigenschappen en stabiliteit wordt DTT veel gebruikt in biochemische en moleculairbiologische experimenten.
De belangrijkste functie van DTT is het reduceren van disulfidebindingen in eiwitten en andere biomoleculen. De disulfidebinding is een belangrijk onderdeel van de vouwing en stabiliteit van eiwitten, maar onder bepaalde experimentele omstandigheden, zoals reduceerbare SDS-PAGE-analyse, eiwitrecombinatie en -vouwing, is het noodzakelijk om de disulfidebinding te reduceren tot twee thiolgroepen om de ruimtelijke structuur van het eiwit te onthullen. DTT kan reageren met disulfidebindingen en deze reduceren tot mercaptaangroepen, waardoor de ruimtelijke structuur van het eiwit zichtbaar wordt en het gemakkelijker te analyseren en te manipuleren is.
DTT kan ook worden gebruikt om de activiteit en stabiliteit van enzymen te beschermen. Bij sommige enzymgekatalyseerde reacties kan de activiteit van het enzym worden verminderd door het oxidatiemiddel. DTT kan met oxidatiemiddelen reageren en deze reduceren tot onschadelijke stoffen, waardoor de activiteit en stabiliteit van het enzym worden beschermd.
Vergeleken met traditionele reductiemiddelen zoals β-mercaptoethanol (β-ME), wordt DTT beschouwd als een veiliger en stabieler reductiemiddel. Het is niet alleen stabiel in waterige oplossing, maar behoudt ook zijn reducerende eigenschappen bij hoge temperaturen en in zure en basische omstandigheden.
Het gebruik van DTT is relatief eenvoudig. Over het algemeen wordt DTT opgelost in een geschikte buffer en vervolgens toegevoegd aan het experimentele systeem. De optimale concentratie van DTT moet worden bepaald aan de hand van het specifieke experiment en ligt doorgaans tussen 0,1 en 1 mM. Lagere concentraties kunnen nadelige effecten op de celgroei verminderen en cytotoxiciteit als gevolg van overexpressie van doelwitproteïnen tegengaan. Hogere concentraties kunnen een te hoge metabolische belasting van de cellen veroorzaken, wat de celgroei en de expressie-efficiëntie kan beïnvloeden.
De optimale concentratie kan worden bepaald door het expressieniveau van het doelwitproteïne te evalueren met behulp van IPTG-inductietesten bij verschillende concentraties. Kleinschalige kweekproeven kunnen worden uitgevoerd met een reeks IPTG-concentraties (bijv. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, enz.) en het expressie-effect bij verschillende concentraties kan worden geëvalueerd door het expressieniveau van het doelwitproteïne te meten (bijv. Western blot of fluorescentiedetectie). Op basis van de experimentele resultaten werd de concentratie met het beste expressie-effect geselecteerd als de optimale concentratie.
Daarnaast kunt u ook de relevante literatuur of de ervaringen van andere laboratoria raadplegen om inzicht te krijgen in het gangbare concentratiebereik van IPTG onder vergelijkbare experimentele omstandigheden, en dit vervolgens optimaliseren en aanpassen aan de experimentele behoeften.
Het is belangrijk om te weten dat de optimale concentratie kan variëren afhankelijk van verschillende expressiesystemen, doelwitproteïnen en experimentele omstandigheden. Optimalisatie is daarom het beste per geval te bepalen.
Samenvattend is DTT een veelgebruikt reductiemiddel dat ingezet kan worden om disulfidebindingen in eiwitten en andere biomoleculen te reduceren en de activiteit en stabiliteit van enzymen te beschermen. Het wordt veelvuldig gebruikt in biochemische en moleculairbiologische experimenten.
Geplaatst op: 28 september 2023